近日，中国科学院深圳先进技术研究院陈业团队于国际期刊Metabolic Engineering发表研究论文"Versatile xylose and arabinose genetic switches development for yeasts"。该研究利用来自曲霉菌种的转录激活因子XlnR和AraR^A以及细菌转录阻遏因子XylR和AraR^R，在酵母中开发了基于廉价诱导剂的高诱导强度，低泄漏的木糖和阿拉伯糖诱导系统。

酿酒酵母作为重要的真核模式生物和细胞工厂，已经有大量的天然或人工诱导系统被开发。但是，用于实际生产的大规模发酵的诱导系统依然局限于内源的半乳糖(GAL)系统。然而，半乳糖诱导系统存在若干不足，主要表现在对葡萄糖的抑制作用导致生长与生产过程难以分离，以及复杂的内源调控网络在不同营养条件下导致诱导动力学行为的复杂性。此外，基因表达的诱导依赖于易降解且成本较高的半乳糖。D-木糖和L-阿拉伯糖作为农业废弃物（如秸秆）水解产物的主要组分，具有成本低廉的优势。鉴于酿酒酵母无法天然降解这些糖类，它们成为理想的专一性诱导剂，可用于生产大量化学品或蛋白质。

自2015年以来，科学家已经在酵母中开发了一些木糖基因表达诱导系统。过往的木糖诱导系统大多基于原核生物的阻遏转录因子XylR^R构建，但是这些系统都有一个普便存在的问题：最大诱导转录水平偏低，且转录因子的浓度需要细调以避免引发宿主生长毒性。内在调控原理-阻遏转录因子的去阻遏以及原核生物与真核生物的转录激活机制的截然不同，决定了很难改造已有的木糖转录诱导系统。

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丝状真菌是生态环境中的分解者，具有强大的分解代谢能力，因此研究团队着重在这类菌种中筛选能响应木糖及阿拉伯糖的转录激活因子。通过构建基于荧光报告基因的筛选系统，团队最终找到了来自构巢曲霉和黑曲霉的转录激活因子-XlnR (AN7610)和AraR^A (An04g08600)，能在酿酒酵母中分别剂量响应木糖及阿拉伯糖并启动下游基因转录表达。

为克服天然启动子的局限性，如序列冗长、转录调控信号多样及结构复杂性，研究团队采用结构紧凑的酿酒酵母ADH2强诱导型启动子作为基础，将XlnR的结合一致性序列xlno替换ADR1的结合序列，成功开发出响应木糖的半合成启动子，显著增强了木糖诱导下的基因转录表达。通过构建TSS与TATA-box、TATA-box与poly(A)区域间隔序列的文库，并调整转录因子结合基序（motif）的数量，成功开发出具有广泛动态范围的全合成诱导启动子。

基于转录激活因子的诱导系统通常泄漏水平较高，为应对泄漏水平较高的问题，研究团队引入了原核生物的转录阻遏抑制信号，并设计了转录激活/抑制的双调控系统。这一创新使得木糖双调控系统的动态范围扩展至4000倍以上，且最大诱导转录活性达到酿酒酵母强组成型启动子TDH3活性的两倍以上。同样阿拉伯糖双调控诱导系统动态范围达300倍，最大诱导转录活性与TDH3启动子活性相当。重要的是，农业废弃物如玉米芯未经处理的水解物也可以充分激活该木糖诱导系统。最后，研究团队综合比较了本研究开发的木糖及阿拉伯糖诱导系统与酿酒酵母中常用的诱导系统（天然系统如GAL系统,Cu²⁺诱导启动子P_CUP1,甲硫氨酸抑制启动子P_MET3以及基于雌激素受体ER的合成诱导系统LexA-ER-VP16/B112），证实木糖双调控系统就调控严谨性，诱导激活水平、动态范围、诱导速度和对宿主的生长影响方面优于现有系统。

研究团队验证了这两套诱导系统在高滴度（>100 mg/L）芳樟醇生产中的实用性，同时证实了使用玉米芯水解物作为唯一碳源和诱导剂来源，也能实现高滴度芳樟醇的生产。最后，团队也证明了基于XlnR的木糖诱导系统可迁移到工业菌株如毕赤酵母、病原菌如光滑念珠菌和白色念珠菌（CUG支系酵母）。在毕赤酵母中，基于XlnR的木糖诱导系统的最大诱导水平高于其经典的甲醇诱导系统，并证实了其用于生产分泌蛋白的实用性。

本研究不仅为酵母提供了强大的遗传开关，还提出了一种将激活/抑制信号整合到合成启动子中的通用策略，以实现最优性能。

木糖及阿拉伯糖诱导系统开发策略，设计原理及应用

本文第一作者是中国科学院深圳先进技术研究院助理研究员郭淑慧，通讯作者是中国科学院深圳先进技术研究院研究员陈业。该工作获得了国家重点研发计划、国家自然科学基金，以及深圳合成生物学创新研究院的支持。

团队相关亮点成果

通过与该研究相似的转录因子重构结合合成启动子方法，以及对于转录因子表达量、DNA结合结构域及启动子模块的精准设计，可以在酿酒酵母及大肠杆菌中对于任意转录信号进行优化。基于该方法，陈业团队与湖南大学的合作成果，以"On-Chip Engineered Living Materials as Field-Deployable Biosensing Laboratories for Multiplexed Detection"为题，已在Advanced Functional Materials期刊上发表，中国科学院大学硕士黎欣睿完成了细胞传感器的开发。

原文链接

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202416830

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